Efecto del colesterol sobre la motilidad e integridad de membrana en
espermatozoide criopreservado de alpaca
Cholesterol effect on motility and membrane integrity of cryopreserved
sperm of alpaca
Rene Ciprian
a,b,*
, Hernán C. Cucho
a
, Armando E. Alvarado
b
,
Amalia del Pilar Gallejos-Cárdenas
b,c
a
Laboratorio de Reproducción Animal, Escuela Profesional de Zootecnia, Universidad Nacional San
Antonio Abad del Cusco, Cusco, Perú.
b
Laboratorio de Biotecnología Reproductiva, Facultad de Zootecnia, Universidad Nacional Agraria La
Molina, Lima, Perú.
c
Servicio de Reproducción Animal, Programa de Mejoramiento Animal, Universidad Nacional Agraria
La Molina, Lima, Perú.
* Autor de correspondencia: rene_ciprian@hotmail.com
https://doi.org/xxxxxxxx
Recepción: 16 de noviembre 2020 | Aprobación: 12 de diciembre 2020 | Publicación: 01 de enero 2021
Resumen
El objetivo del estudio fue evaluar el efecto de la adición de colesterol sobre la motilidad e
integridad de acrosoma del espermatozoide criopreservado de alpaca. Se utilizaron 15
eyaculados obtenidos de alpaca y colectados por vagina artificial. La motilidad inicial fue
mayor al 60 %. Las variables evaluadas fueron la motilidad e integridad de membrana de
espermatozoide posdescongelado. La viscosidad de semen fresco fue tratada con una
solución de colagenasa al 0,1 % y posteriormente la muestra tratada, fue dividido en tres
alícuotas para la adición de 0,2 y 4 mg de ciclodextrina cargada de colesterol (CLC) por cada
120 millones de espermatozoides. La dilución se realizó en dos pasos, con un dilutor Tris +
20 % de yema de huevo, se usó 6 % de glicerol como crioprotector, envasado en pajuelas de
0,5 ml y la congelación horizontal en vapores de nitrógeno y almacenado en nitrógeno
líquido. El análisis de los resultados preliminares de motilidad e integridad de membrana
espermático posdescongelado fueron analizados como un DBCA. Se encontró diferencia
altamente significativa (P<0,01) entre tratamientos para motilidad espermática y no se
encontró diferencia significativa (P>0,05) para la integridad de membrana espermática. Los
resultados muestran un incremento favorable al uso de colesterol en la criopreservación de
semen.
Palabras clave: alpaca, espermatozoide, criopreservación, colesterol, motilidad, integridad
de membrana
Revista de Invest. Agropecuaria Science and Biotechnology
e-ISSN: En trámite
Vol. 01, No. 01, enero- marzo 2021, 17-22
Ciprian, et al.
18
Rev. Agrop. Sci. & Biotech. Vol. 01, No. 01, 2021. pp. 17-22
Abstract
The objective of the study was to evaluate the effect of the addition of cholesterol on the
motility and integrity of the acrosome of the cryopreserved alpaca sperm. We used 15
ejaculates obtained from alpaca collected by artificial vagina, the initial motility was greater
than 60%. The variables evaluated were motility and membrane integrity of post-thawed
spermatozoa. The fresh semen viscosity was treated with a 0.1% collagenase solution and
then, the treated sample was divided into three aliquots for the addition of 0, 2 and 4 mg of
cholesterol-loaded cyclodextrin (CLC) per 120 million spermatozoa. The dilution was in two
steps with a Tris diluent + 20% egg yolk, 6% glycerol was used as cryoprotectant, loaded in
0.5 ml straws and horizontal freezing in nitrogen vapors and stored in liquid nitrogen. The
analysis of the preliminary results of motile and membrane integrity of post-thawed
spermatic were analyzed as a DBCA. We found a significant difference (P <0.01) between
treatments for sperm motility and no significant difference (P> 0.05) was found for sperm
membrane integrity. The results show a favorable increase in the use of cholesterol in
cryopreservation of semen.
Keywords: alpaca, sperm, criopreservation, cholesterol, motility, membrane integrity.
1. INTRODUCCIÓN
En las alpacas la supervivencia espermática
de semen después del descongelado es muy
baja, por lo que el uso de la inseminación
artificial en esta especie está limitado, en
comparación a otras especies.
Es conocido el daño causado por
congelación en los espermatozoides, que
influye en la pérdida de motilidad,
viabilidad, integridad acrosomal y la
capacidad fertilizante del esperma
congelado-descongelado (Holt, 2000).
El colesterol cumple un papel importante
en muchas funciones del esperma, que
incluyen efectos sobre las propiedades de la
membrana. De estos efectos, la
estabilización las membranas a bajas
temperaturas y el aumento del contenido
de colesterol de las membranas del
espermatozoide pueden mejorar la calidad
del esperma después del proceso de
descongelación (Mocé et al., 2010a).
Las ciclodextrinas son capaces de transferir
el colesterol o de extraer el colesterol de las
membranas de muchos tipos de células,
incluidos los espermatozoides. Se cree que
esta transferencia se produce por gradiente
de concentración (Moore et al., 2005).
Las ciclodextrinas son oligosacáridos
obtenidos de la degradación enzimática del
almidón. Tienen la particularidad de
presentar un exterior hidrofílico y una
cavidad interior hidrofóbica que puede
acoger moléculas orgánicas no polares,
como los lípidos.
Varios estudios obtuvieron un mayor
porcentaje de supervivencia después del
proceso de descongelación, cuando los
espermatozoides fueron tratados con
ciclodextrina cargada de colesterol (CLC)
antes de la congelación en equinos (Moore
et al., 2005), en toros (Purdy y Graham,
2004), carneros (Mocé et al., 2010b) y
dromedarios (Crichton et al., 2015).
El objetivo del estudio fue evaluar el efecto
de la adición de colesterol sobre la
motilidad e integridad de espermatozoide
criopreservado de alpaca.
Efecto del colesterol en la motilidad de espermatozoide de alpaca
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2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Ubicación y duración de la
investigación
El estudio fue realizado en los meses de
enero a abril del 2017, en el Centro de
Investigación en Camélidos Sudamericanos
(CICAS) La Raya, de la Universidad
Nacional de San Antonio Abad del Cusco a
4133 metros de altitud.
2.2. Muestras y procedimientos
Se utilizaron 5 alpacas machos de entre 5 a
6 años de edad, que aceptaban la colección
de semen por vagina artificial en maniquí.
El tiempo de colección de semen fue a
intervalos de una semana. Los animales
fueron mantenidos con una alimentación
en pastura natural. Se obtuvieron tres
muestras de semen por alpaca. La
evaluación de motilidad en integridad de
membrana fue realizada en semen
descongelado. Para ello, se utilizó un
microscopio de contraste de fases con
platina caliente, y se capturaron imágenes
en un equipo ISAS
®
v. 1.2. La motilidad
espermática fue determinada por la
observación del movimiento de la cola del
espermatozoide a 200x de aumento, para
ello se empleó 5 ul de semen sobre un
portaobjetos. La integridad de membrana
fue determinada por la prueba de HOST
(Hipo Osmotic Swelling Test) mediante
una solución hiposmótica con osmolaridad
de 50 mOsm/Kg, donde 25 µL de semen
fueron incubados en 100µL del medio,
durante 15 minutos a 37 °C, y al final se
agregó una solución formolada para
detener la reacción. La evaluación
microscópica fue a 400x, donde se observó
el enrollamiento de la cola del
espermatozoide.
Al inicio, el semen fresco fue tratado con
una solución de colagenasa al 0,1 %,
incubado a 37 °C por 4 minutos, se
centrifugó a 3000 rpm/5 min, se eliminó el
sobrenadante, se dividió en tres alícuotas
(tratamiento) para adición de 0,2 y 4 mg de
CLC por cada 120 millones de
espermatozoides y posteriormente
incubado a 37°C por 15 minutos (Purdy y
Graham, 2004). Después se hizo una
primera dilución (1:1) con dilutor tris + 20
% de yema de huevo y luego fue llevado a
refrigeración a 4 °C por 2 horas.
Posteriormente a este tiempo se hizo una
segunda dilución (2:2) con dilutor tris +20
% de yema de huevo y 12 % de glicerol. El
envasado se realizó en pajuelas de 0,5 ml y
un periodo de equilibrado de 1 hora a 4 °C.
El tipo de congelación fue horizontal en
vapores de nitrógeno y almacenado a -196
°C en nitrógeno líquido. El descongelado
fue después de 7 días.
2.3. Análisis estadístico
En el análisis estadístico, la normalidad de
la motilidad e integridad de membrana
fueron analizadas con el test de Shapiro-
Wilk. Las variables evaluadas fueron
analizadas en un diseño de bloques
completamente al azar y se empleó el test
de Duncan para comparar las medias.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se trabajó con 15 muestras de semen, cuya
motilidad inicial en semen fresco fue mayor
al 60 %. Los resultados preliminares
muestran que se encontró diferencia
estadística significativa (P>0.05) entre
machos, para las variables de motilidad e
integridad de membrana en
espermatozoides posdescongelado. Se
encontró diferencia estadística altamente
significativa (P<0,01) entre tratamientos
para la motilidad espermática
posdescongelamiento y no se encontró
diferencia estadística significativa (P>0,05)
entre tratamiento para la integridad de
membrana espermática
posdescongelamiento.
Ciprian, et al.
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Figura 1. Motilidad espermática de semen criopreservado de alpaca, tratado con CLC.
Figura 2. Integridad de membrana espermática en semen criopreservado de alpaca, tratado con CLC.
Los resultados de motilidad en alpacas
siempre han sido bajos, pero si
conseguimos cambiar el contenido de
colesterol de las membranas plasmáticas se
podría mejorar la criosupervivencia
espermática. La adición de 4 mg de CLC,
antes de la criopreservación de semen,
mostró mejores resultados (figura 1). Este
valor es superior a lo reportado por Flores
et al. (2015), Zirena (2014) y Olaguivel y
Naveros (2014), quienes obtuvieron 10,4,
18,68 y 24,75 % respectivamente.
Posiblemente esta diferencia se deba a la
adición de colesterol, porque el tratamiento
de la viscosidad fue parecido. Los autores
señalan que las muestras fueron sometidos
a un tratamiento físico y/o enzimático.
También indican que el tipo de dilutor,
nivel de crioprotector, protocolos de
congelación son aspectos que influyen
sobre la supervivencia espermática
posdescongelado.
Choez et al. (2013) indicaron que la
motilidad inicial de trabajo es un aspecto
importante que influye en el resultado final
que se obtendrá. Las muestras con una
motilidad inicial mayor al 60 % logran
mejores porcentajes de motilidad después
29,10
35,11
37,47
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
40,0
0 mg 2 mg 4 mg
MEMBRANA INTACTA (%)
TRATAMIENTOS
21,25
24,77
26,41
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
0 mg 2 mg 4 mg
% DE MOTILIDAD
TRATAMIENTOS
Efecto del colesterol en la motilidad de espermatozoide de alpaca
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del descongelamiento, posiblemente este
aspecto ha influido en los resultados de la
presente investigación porque, en el
tratamiento control, se observó una buena
motilidad espermática.
La adición de CLC, antes del proceso de la
congelación, también ha mejorado el
porcentaje de espermatozoide con
membrana intacta (figura 2). Zirena
(2014), Banda et al. (2010) y Choez et al.
(2013) encontraron valores de 22,82, 24,3 y
36 % de espermatozoides
posdescongelados con membrana íntegra
respectivamente. Estos resultados son
inferiores a los datos obtenidos en la
presente investigación. Posiblemente estas
diferencias se deban al efecto de la adición
de CLC. También por el tipo de semen
(epididimario y/o entero), la osmolaridad
de la solución, ya que al usar un medio de
menor valor hiposmótico se tiene mayor
reacción de la membrana espermática.
Además, indicar que generalmente la
funcionalidad de membrana siempre es un
valor mayor a la motilidad y varía de
acuerdo al resultado de este.
Mocé et al. (2010a), al evaluar los
parámetros de motilidad y la integridad de
membrana plasmática, indica que el
tratamiento de los espermatozoides con
CLC antes de la criopreservación mejora las
tasas de supervivencia en 2 a 24 %. Este
beneficio del tratamiento de CLC depende
del espermatozoide de diferentes especies,
líneas dentro de una especie, entre machos
y para espermatozoides tratados de
diferentes maneras.
4. CONCLUSIONES
La inclusión de colesterol en el proceso de
congelación de semen de alpaca mejora
significativamente las variables de
motilidad e integridad de membrana
espermática, que obtuvo una mayor
supervivencia.
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