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Recibido, 15/01/2021 Aceptado, 13/02/2021
Artículo original
DOI:10.25127/aps.20211.756
Estabilidad de cepas nativas de Trichoderma conservadas mediante liofilización
Stability of native Trichoderma strains preserved by lyophilization
1,2* 2 3
Santos T. Leiva-Espinoza , Elgar Hernández Diaz , Luz Leonor Mattos Calderon
RESUMEN
En este estudio se evaluó la capacidad de especies del género Trichoderma para mantener sus capacidades
reproductivas luego de un procedimiento de liofilización. Durante 90 días se evaluaron la capacidad de producir
conidios y la capacidad de germinación de cuatro cepas conservadas a dos temperaturas diferentes y contrastantes
entre sí, además de la adición de malto dextrina o agua como agente protector. Luego de 90 días de almacenamiento
todas las cepas mostraron altos porcentajes de viabilidad y de producción de esporas. La mayoría de tratamientos
7
redujo su capacidad de producir esporas, sin embargo, la cepa F20M4 produjo 2,88x10 UFC/g luego de 90 días de
almacenamiento, sin variar respecto de la evaluación hecha a los 30 días. Se evidencia que las esporas conservan
mejor su viabilidad al ser conservadas a 28°C, aunque en todos los casos se observaron disminuciones en la
viabilidad de las esporas. Solo siete tratamientos obtuvieron más del 80% de viabilidad de esporas luego de 90 días
de almacenamiento.
Palabras clave: control biológico, conservación, Trichoderma, liofilización, viabilidad.
ABSTRACT
In this study, the ability of Trichoderma to maintain its reproductive capacities after a lyophilization procedure was
studied. During 90 days, the capacity to produce conidia and the germination capacity of 4 strains conserved at two
different and contrasting temperatures were evaluated, in addition to the addition of malt dextrin or water as a
protective agent. After 90 days of storage, all the strains showed high percentages of viability and spore production.
Most of the treatments reduced their capacity to produce spores, however, the F20M4 strain produced 2.88x107
CFU/g after 90 days of storage, without varying with respect to the evaluation made at 30 days. It is evidenced that
the spores better conserve their viability when stored at 28 °C, although in all cases decreases in the viability of the
spores were observed. Only seven treatments obtained more than 80% spore viability after 90 days of storage.
Keywords: biological control, conservation, Trichoderma, lyophilization, viability.
1
Universidad Nacional Agraria La Molina, Programa de Doctorado en Agricultura Sustentable, Lima, Perú.
2
Universidad Nacional Toribio Rodríguez de Mendoza de Amazonas, Instituto de Investigación para el Desarrollo Sustentable de Ceja de Selva,
Amazonas, Perú.
3
Universidad Nacional Agraria La Molina, Facultad de Agronomía, Departamento Académico de Fitopatología, Lima, Perú.
*
Autor de correspondencia: e-mail: santos.leiva@untrm.edu.pe
Rev. de investig. agroproducción sustentable 5(1): 25-31, 20 1 2520-97602 ISSN:
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I. INTRODUCCIÓN
Una alternativa sostenible para disminuir el impacto
ambiental causado por el frecuente uso de agroquími-
cos en el control de plagas y enfermedades de los culti-
vos se basa en la utilización de agentes de control bio-
lógico. Dentro de estos agentes destacan los hongos
del género Trichoderma, reconocidos por su actividad
antagónica contra algunos hongos fitopatógenos y por
su efecto como promotor de crecimiento en plantas
(Benítez et al., 2004; Druzhinina et al., 2010).
Los hongos del genero Trichoderma son los antago-
nistas más utilizados a nivel mundial debido a su ubi-
cuidad, facilidad para ser aislados y cultivados, a su
rápido crecimiento en un gran número de sustratos, a
que no son patógenas de plantas y mediante aplicacio-
nes foliares puede prevenir enfermedades en un
amplio rango de cultivos. Estos hongos se encuentran
en todas las zonas climáticas debido a su notable adap-
tación (Benítez et al.,2004; Bateman et al., 2005).
Para elaborar formulaciones con microorganismos, las
células, las esporas o cualquier parte biológica, prime-
ramente, deben someterse a un proceso de conserva-
ción para inducir la latencia y proporcionar estabilidad
del producto por un tiempo prolongado. Existen méto-
dos de conservación, tales como congelación, secado
o liofilización. Eeste último ha resultado ser el más
beneficioso para mantener la viabilidad de los
microorganismos y su funcionalidad distintiva (Day y
Stacey, 2007). Los microorganismos liofilizados están
encerrados en una estructura vítrea, que es muy benefi-
ciosa para el almacenamiento a largo plazo de
microorganismos deshidratados, y también se pueden
almacenar y ser transportados a temperatura ambiente
(Day y Stacey 2007). La adición de crioprotectores es
considerada benéfica durante el proceso de liofiliza-
ción como la malto dextrina que protege contra la
desnaturalización de proteínas (Tan et al., 2007). Un
producto de control biológico, para tener posibilidades
de competir comercialmente con productos químicos,
debe tener una vida útil mínima de uno a dos años a
temperatura ambiente (Abadias et al., 2000). Por lo
tanto, formulaciones de hongos deshidratados son
atractivas debido a su larga vida útil, fácil manipula-
ción y almacenamiento a temperatura ambiente (Pe-
dreschi y Aguilera, 1997).
En este orden de ideas, en el presente estudio se evalúa
la estabilidad de cinco cepas nativas de hongos del
genero Trichoderma basados en la conservación de la
capacidad de producir conidios y de viabilidad de
conidios liofilizados conservados a diferentes tempe-
raturas.
II. MATERIALES Y METODOS
Adquisición de Trichoderma spp.
Se utilizaron cinco cepas de Trichoderma spp: IP3M2-
C4, BIF7-C3, F20M4, BIPF5-C2D2 y AP1M5-C1.
Estas cepas fueron aisladas de agroecosistemas de
cacao de las provincias de Bagua y Utcubamba como
parte de un estudio de diversidad.
Estas cepas se conservaron a 4°C en el laboratorio de
Entomología y Fitopatología de la Universidad Nacio-
nal Toribio Rodríguez de Mendoza de Amazonas.
Diseño experimental
Para esta investigación se utilizó un DCA (diseño
completamente al azar) con un arreglo factorial 5A x
3B x 2C, donde A son las cepas de Trichoderma spp.
(IP3M2-C4, BIF7-C3, F20M4, BIPF5-C2D2 y
AP1M5-C1), B es la temperatura de almacenamiento
(4 y 28°C) y C los protectores (agua, malta), para un
total de 20 tratamientos con tres repeticiones cada uno.
El detalle de tratamientos se describe en la Tabla 1.
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Tabla 1. Descripción de tratamientos
Cepa Agente Protector Temperatura N° de tratamiento
IP3M2-C4 Malta 4°C 1
IP3M2-C4 Malta 28°C 2
IP3M2-C4 Agua 4°C 3
IP3M2-C4 Agua 28°C 4
BIPF5-C2D2 Malta 4°C 5
BIPF5-C2D2 Malta 28°C 6
BIPF5-C2D2 Agua 4°C 7
BIPF5-C2D2 Agua 28°C 8
BIF7-C3 Malta 4°C 9
BIF7-C3 Malta 28°C 10
BIF7-C3 Agua 4°C 11
BIF7-C3 Agua 28°C 12
F20M4 Malta 4°C 13
F20M4 Malta 28°C 14
F20M4 Agua 4°C 15
F20M4 Agua 28°C 16
AP1M5-C4 Malta 4°C 17
AP1M5-C4 Malta 28°C 18
AP1M5-C4 Agua 4°C 19
AP1M5-C4 Agua 28°C 20
Producción de Trichoderma spp. en sustrato sólido
La producción de Trichoderma spp. se realizó en sus-
trato de arroz pre-cocido estéril. Se transfirieron 200 g
de arroz en matraces de 500 ml, se añadió la suspen-
sión de Trichoderma previamente estandarizada de
7
conidios (3.68x10 UFC/ml). Luego se incubaron a
28°C durante 12 días. Los cultivos se agitaron diaria-
mente a mano para mantener las condiciones aeróbi-
cas de Trichoderma spp. y favorecer la conservación
de la biomasa en el proceso de liofilización (Grze-
gorczyk et al., 2018).
Proceso de liofilización
Pasados los 12 días de incubación y con el sustrato
cubierto de micelio y conidios se procedió a liofilizar
cada uno de los tratamientos. Para preparar el sustrato
para la liofilización fueron transferidos 200 gramos de
arroz de Trichoderma spp. matraz de 500 ml y se aña-
dió 20 ml de una solución estéril de maltodextrina
(Malta) al 20% o agua destilada estéril, según los trata-
mientos descritos en la tabla 1, como agentes protecto-
res de conidios, se homogenizó adecuadamente la
mezcla y se secó en frío con el liofilizador de tríada
Labconco, en un colector una presión de 0,2 mbar
durante 24 h. Posteriormente, los liofilizados se trans-
firieron a tubos plásticos de 50 ml de capacidad y
almacenados a una temperatura de 4°C y 28°C según
los tratamientos descritos.
Concentración de conidios
La concentración de conidios·mL-1 se determinó
mediante la fórmula siguiente de Reyes-Figueroa et al.
(2016).
6
C = (Cc) (4 x 10 ) (Fd / 80)
Donde:
C = Concentración (conidios·mL-1)
Cc = Promedio de conidios contados en la cámara de
Neubauer
Fd = Factor de dilución.
Estabilidad de Trichoderma spp. en almacenamiento
Para determinar la vida útil de las cepas de Trichoder-
ma spp. se evaluó la viabilidad expresada como la
capacidad de germinación de los conidios formulados
durante tres meses de almacenamiento. Las evaluacio-
nes se realizaron mensualmente, la dilución que reali-
zó el conteo de esporas se sembró por triplicado en
placas Petri con medio agar PDA y se incubaron a 28
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28
°C durante 18 horas. Se cuantificaron 100 conidios
entre germinados y no germinados mediante observa-
ción al microscopio de cinco campos ópticos por uni-
dad experimental (Ekesi et al., 1999).
Análisis estadístico
Todos los análisis se realizaron con el software esta-
dístico Infostat V. 2020. Se realizaron análisis de
varianza para determinar la existencia de diferencias
entre las medias obtenidas para concentración de coni-
dios y porcentaje de germinación. Cuando se identifi-
caron diferencias estadísticas se procedió a realizar
una prueba de comparación de medias, específicamen-
te la prueba Scott Knott (α=0,05).
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las medias de concentración de conidios producidos
por cada uno de los tratamientos mostraron diferencias
estadísticas significativas (p<0,001). Diversas tenden-
cias se observan entre los tratamientos según la cepa
evaluada y la temperatura de almacenamiento a 30, 60
y 90 días de evaluación (Tabla 2).
En la mayoría de tratamientos se aprecia una disminu-
ción de la capacidad de producir conidios, tanto para
tratamientos con adición de Malta como de agua desti-
lada. A los 90 días de evaluación las tres cepas que
obtuvieron la mayor producción de conidios son las
que fueron conservadas a 28 °C y usando extracto de
Tabla 2. Concentración de conidios durante los tres meses de almacenamiento (medias con letras diferentes son significativamente diferentes,
Scott Knott, α = 0,05)
Cepa
Agente
protector
Temperatura Tratamiento
Concentración de esporas (x10
7
UFC/g)
30 días 60 días 90 días
IP3M2-C4 Malta 4°C 1 1,23d 1,1d 0,68d
IP3M2-C4 Malta 28°C 2 2,7b 2,07c 3,32ª
IP3M2-C4 Agua 4°C 3 0,87d 0,73d 0,6d
IP3M2-C4 Agua 28°C 4 2,02c 1,78c 2,55b
BIPF5-
C2D2 Malta 4°C 5 1,28d 1,28d 0,98d
BIPF5-
C2D2 Malta 28°C 6 1,85c 1,92c 1,67c
BIPF5-
C2D2 Agua 4°C 7 1,2d 1,2d 0,65d
BIPF5-
C2D2 Agua 28°C 8 2,07c 1,45d 1,55c
BIF7-C3 Malta 4°C 9 2,63b 1,97c 2,03b
BIF7-C3 Malta 28°C 10 3,63ª 2,15b 3,42ª
BIF7-C3 Agua 4°C 11 1,63c 1,8c 0,93d
BIF7-C3 Agua 28°C 12 2,73b 2,27b 2,45b
F20M4 Malta 4°C 13 3,77ª 1,88c 1,77c
F20M4 Malta 28°C 14 3,68ª 2,87ª 3,17ª
F20M4 Agua 4°C 15 3,05b 1,72c 1,07d
F20M4 Agua 28°C 16 2,88b 2,22b 2,88ª
AP1M5-C4 Malta 4°C 17 1,87c 1,27d 1,03d
AP1M5-C4 Malta 28°C 18 2,87b 2,3b 1,52c
AP1M5-C4 Agua 4°C 19 1,22d 1,67c 1,02d
gAP1M5-C4 Agua 28°C 20 1,4d 1,63c 2,17b
Malta como agente protector. Estos resultados difieren
a los obtenidos por Grzegorczyk et al. (2018), quienes
registran cepas con concentraciones superiores a
8
7×10 UFC/g sobre paja de arroz como sustrato de
fermentación después del período de incubación de
tres meses utilizando malto dextrina como agente
protector. Tewari y Bhanu (2004), alcanzaron produc-
8
ciones de conidios de 2,8 ×10 UFC/g utilizando paja
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Tabla 3. Porcentajes de germinación de conidios durante los tres meses de almacenamiento (medias con letras diferentes son significativamente
diferentes, Scott Knott, α = 0,05).
Cepa
Agente
protector
Temperatura Tratamiento
Germinación de esporas (%)
30 días
60 días 90 días
IP3M2-C4 Malta 4°C 1 60,73b 60,6c 58c
IP3M2-C4 Malta 28°C 2 90,87ª 87,27a 84,13ª
IP3M2-C4 Agua 4°C 3 58,27c 60,4c 55,8c
IP3M2-C4 Agua 28°C 4 89,6ª 87,2a 85ª
BIPF5-C2D2 Malta 4°C 5 58,47c 61,07c 60c
BIPF5-C2D2 Malta 28°C 6 89,6ª 84,73b 79,53b
BIPF5-C2D2 Agua 4°C 7 61,8b 57,6c 59c
BIPF5-C2D2 Agua 28°C 8 88,6ª 84b 78,2b
BIF7-C3 Malta 4°C 9 60,8b 58,93c 58,8c
BIF7-C3 Malta 28°C 10 93,53ª 91,13a 90,53a
BIF7-C3 Agua 4°C 11 57,2c 57,47c 55,8c
BIF7-C3 Agua 28°C 12 88,8ª 83,67b 80,93b
F20M4 Malta 4°C 13 62,33b 62,67c 61c
F20M4 Malta 28°C 14 91,6ª 90,33a 91ª
F20M4 Agua 4°C 15 56,53c 59,33c 56,8c
F20M4 Agua 28°C 16 87,4ª 82,8b 79,2b
AP1M5-C4 Malta 4°C 17 60,73b 61,2c 59,93c
AP1M5-C4 Malta 28°C 18 89,4ª 89,27a 88,4ª
AP1M5-C4 Agua 4°C 19 56,67c 58,93c 60,6c
AP1M5-C4 Agua 28°C 20 89,93ª 88,27a 87,67a
de trigo como sustrato de fermentación. Por su parte,
8 8
Witkowska et al. (2016) alcanzaron 1,7×10 y 5,3×10
UFC/g al evaluar el efecto de la liofilización sobre la
supervivencia y la cinética del crecimiento de cepas de
Trichoderma. En ambos estudios se alcanzaron con-
centraciones superiores a las más altas registradas en
nuestro estudio. Eesto podría deberse a diversas cau-
sas, entre las más probables podrían destacarse el
diferente sustrato de concentración y la diferente capa-
cidad de producción de conidios que tienen las cepas
diferentes en hongos del género Trichoderma.
Las medias de viabilidad de conidios mostraron dife-
rencias altamente significativas entre los tratamientos
evaluados (p<0,0001).
Todos los tratamientos almacenados a 4 ◦C presenta-
ron germinaciones menores al 80% luego de 90 días de
evaluación (Tabla 3). Valores que están por debajo de
los márgenes establecidos como estándares nacionales
e internacionales de calidad, que sugieren en la viabili-
dad como límite mínimo de aceptación para productos
biológicos (Jenkins y Grzywacz, 2000). Estos resulta-
dos contrastan con los obtenidos por Papavizas
(1985), que demostró que los conidios de T. viride no
lograron mantenerse viables por un tiempo superior a
20 semanas cuando son almacenados a 30°C.
Para los tratamientos almacenados a 28°C se alcanza-
ron medias por encima del 80% en la mayoría de los
casos (Tabla 3). Esto podría estar relacionado con los
excipientes empleados para la liofilización, ya que la
Malta se considera una sustancia protectora de secado
que tiene un efecto osmorregulador sobre el microorga-
nismo (Teixido et al., 2005; Grzegorczyk et al., 2018).
El retraso en la germinación de los conidios posible-
mente se debe a la deshidratación que sufre durante el
tiempo de almacenamiento, lo cual aumenta la tensión
superficial. Cuando la temperatura es mayor tiene
consecuencias negativas en la viabilidad de los
microorganismos durante el almacenamiento y es
probable que a mayor temperatura exista una mayor
reactividad de las moléculas, presentándose reaccio-
nes de degradación que pueden ser tóxicas para el
microorganismo (Burges, 1998; Chen et al., 2008). En
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nuestro trabajo la incorporación de la Malta aumentó
la capacidad de conservar la viabilidad y logró una
mejor estabilidad tanto para producción de conidios
como para el porcentaje de germinación en ambas
temperaturas de conservación.
V. CONCLUSIONES
La biomasa de Trichoderma spp. y la viabilidad de los
conidios luego del proceso de liofilización está nece-
sariamente relacionada con la temperatura. Basados
en la capacidad de producir conidios y la conservación
de viabilidad de conidios los tratamientos que mostra-
ron mejores resultados son los que estuvieron almace-
nados a 28°C. Por otro lado, los aditivos influyeron en
la concentración y viabilidad de conidios luego de la
liofilización y almacenamiento. Además, el uso de
Malta obtuvo mejores resultados comparados con el
agua. Estos resultados confirman el efecto protector
que ejercen los excipientes sobre el principio activo,
manteniendo su viabilidad durante el tiempo de alma-
cenamiento.
V. AGRADECIMIENTO
Este estudio fue financiado por el Fondo Nacional de
Desarrollo Científico, Tecnológico y de Innovación
Tecnológica FONDECYT CONTRATO N° 10-2018-
FONDECYT-BM-ADT-AV
VI. CONFLICTO DE INTERESES
Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
VII. CONTRIBUCIÓN DE LOS AUTORES
Conceptualización, Santos Leiva y Elgar Hernandez;
metodología, Santos Leiva y Leonor Mattos; análisis
formal, Elgar Hernandez; Investigación, Elgar Her-
nandez y Santos Leiva; preparación de manuscrito
(borrador), Elgar Hernandez; Revisión y edición de
Manuscrito, Santos Leiva y Leonor Mattos; adquisi-
ción de fondos, Santos Leiva. Todos los autores han
leído y están de acuerdo con la publicación de esta
versión del manuscrito.
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Trichoderma nativa liofilización
Leiva-Espinoza ST
